Установление групповой принадлежности клеток.
Для установления групповой принадлежности клеток рекомендуется использовать реакцию непрямой иммунофлюоресценции (непрямой РИФ), которую ввели в медицинскую практику А.Н. Coons и М.Н. Kaplan в 1950 году, что, по мнению многих, явилось переломным событием в научных исследованиях в области иммунологии и иммуногистопатологии. Значительно более высокая чувствительность и специфичность, метода иммунофлюоресценции по сравнению с классическими методами исследования, а также возможность обнаружения в тканях и клеток различных субстанций, обладающих свойством антигенов, позволили расширить экспертные возможности.
Подготовка проб и реагентов. Прежде всего необходимо зафиксировать координаты клеток, групповую принадлежность которых требуется установить, записав их цифровые значения как по горизонтали, так и по вертикали на координатном столике микроскопа. Затем следует выбрать и приготовить соответствующим образом сыворотки для реакции, имеющиеся в наличие в лаборатории. Можно использовать гетероиммунные группоспецифические сыворотки, а также изосерологические сыворотки и моноклональные антитела. Титр вышеуказанных реагентов должен составлять 1:64-1:128.
Затем следует приготовить флюоресцирующую сыворотку, рабочее разведение которой должно составлять 1:16. Для этого сначала надо определить ее красящий титр. В зависимости от того, какую сыворотку, меченую флюорохромом используют (против глобулинов кролика барана, человека или мыши) следует подобрать к ней соответствующие гомологичные антигены. Если красящий титр будет устанавливаться посредством прямой РИФ, то антиген разводится 1:1000, если посредством непрямой РИФ, то -1:10000.
Затем флуоресцирующая сыворотка в кратных разведениях от 1:2 до 1:1024 наносятся на приготовленный соответствующим образом антиген (разведенный, нанесенный на предметные стекла, высушенный при комнатной температуре в течение 15 мин метанолом) и препараты инкубируются во влажных камерах, в течение 20 минут. Если титр устанавливался методом прямой РИФ, то после отмывания от несвязанных антител 4 раза по 5 минут физиологическим раствором препараты подвергают микроскопии на флуоресцентном микроскопе. Если же есть возможность провести непрямую РИФ, то производят инкубацию в течение 20 минут во влажных камерах со второй сывороткой, затем производят отмывание от несвязанных антител аналогично вышеописанному и подвергают препараты микроскопии при тех же параметрах. Главная задача: установить два смежных разведения флюоресцирующей: сыворотки, при которых происходит выраженный перепад в свечении исследуемого препарата (например, в разведении 1:512 свечение наблюдается, а при разведении 1:1024 его нет). Это и будет являться красящим титром сыворотки.
Установив красящий титр, следует рассчитать во сколько раз надо ее развести, чтобы она имела титр 1:32, который чаще всего указан на ампуле (например при красящем титре 1:512 сыворотку надо развести в 16 раз). Затем разведенную соответствующим образом сыворотку подвергают истощению ацетоновым печеночным порошком (на 1 мл сыворотки 80 мг порошка), приготовленным из печени человека или свиньи. В процессе истощения титр сыворотки снижается на 1 ступень (в 2 раза) и в результате получается нужное нам рабочее разведение 1:16.
Техника постановки реакции. На исследуемые препараты наносят группоспецифическую сыворотку в титре 1:64-1:128 и инкубируют препараты во влажных камерах в течение 18 часов в условиях бытового холодильника. Затем производят отмывание от несвязанных антител 4 раза по 5 минут физиологическим раствором, тщательно высушивают препараты и производят их инкубацию с соответствующей истощенной флюоресцирующей сывороткой в течение 1 часа во влажных кам:ерах при комнатной температуре. Затем производят отмывание от несвязанных антител аналогично вышеописанному и подвергают препараты микроскопии на флуоресцентном микроскопе. При выявлении антигена мембраны клеток будут сильно флуоресцировать, а при невыявлении свечения наблюдаться не будет. Группоспецифические антигены системы АВО локализуются в клеточных мембранах.
Для установления групповой принадлежности клеток вышеописанную процедуру следует провести последовательно: сначала для выявления антигена А, затем антигена В, и наконец антигена Н, для которого следует найти гетероиммуную сыворотку с достаточно высоким титром. Желательно ввести параллельно в реакцию клетки буккального эпителия заведомых доноров, группа крови которых по системе АВО хорошо известна и не вызывает сомнений.
