Приготовление препаратов микроорганизмов и их исследование под микроскопом.
Для микроскопирования пробы готовится препарат. Для этого капля пробы помещается на предметное стекло и накрывается покровным. Предметное стекло представляет собой стеклянную пластинку размером 76х26 мм и толщиной не более 1.1 мм. Покровные стекла тонкие (толщина 0,15-0,17 мм), квадратные и небольших размеров (18х18 или 24х24 мм). Новые предметные и покровные стекла кипятят в мыльной дистиллированной воде 10-20 минут, затем промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой, сушат или протирают полотняной тканью. Предметные и покровные стекла хранят сухими в закрытой посуде или в 95%-ном спирте.
Перед приготовлением препаратов микробиологический стол протирают от пыли ватным тампоном, смоченным спиртом. Руки моют и также протирают спиртом. Предметные и покровные стекла достают из спирта пинцетом, протирают чистой мягкой тканью или фильтровальной бумагой и досушивают в пламени спиртовки.
Препараты живых микроорганизмов.
Для определения формы микроорганизмов, их подвижности, физиологического состояния готовят препараты живых микроорганизмов и ведут прижизненное наблюдение.
Приготовление препарата для наблюдения в раздавленной капле. На чистое предметное стекло стерильной петлей помещают каплю исследуемой жидкости и накрывают покровным стеклом. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться ребром его к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить. Иногда под стеклом остаются пузырьки воздуха. Если пузырьки воздуха единичные, то они не мешают микроскопированию и ими можно воспользоваться при отыскании мелких микроорганизмов в поле зрения микроскопа. Если пузырьков воздуха много, то препарат следует переделать. Капля должна быть небольшой, чтобы жидкость не выступала за края покровного стекла. Излишек жидкости, вышедшей из-под покровного стекла, удаляют полосками фильтровальной бумаги.
Если рассматривают культуру, выросшую на плотной питательной среде, то на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и в нее вводят иглой небольшое количество исследуемой культуры. Приготовленный препарат рассматривают под микроскопом.
Приготовление препарата для наблюдения в висячей капле. Для этого используют предметное стекло со специальным углублением, с луночкой. Висячей каплей удобнее пользоваться для наблюдения-подвижности микроорганизмов, размножения, прорастания спор. Препарат готовят так: в центр покровного стекла помещают небольшую каплю жидкости с микроорганизмами, покровное стекло с каплей культуры накрывают предметным стеклом с лункой, предварительно смазав ее края тонким слоем вазелина, предметное стекло осторожно прижимают к покровному и быстро перевертывают препарат.
Изучение клеточных структур. Микроорганизмы можно наблюдать в неокрашенном виде и с прижизненной окраской. Для этого используют малоконцентрированные растворы различных красок, которые не оказывают на микроорганизмы губительного действия, дифференцированно окрашивают содержимое клетки и способствуют более точному изучению формы клеточных структур. Для прижизненной окраски дрожжей и бактерий применяют нейтральную красную, метиленовую синюю, нейтральную фиолетовую, зеленый янус, эозин и эритрозин в очень незначительных концентрациях— от 0,001 до 0,0001%. Окрашенный препарат готовят введением под покровное стекло небольшой капли раствора красителя или микроорганизмы вносят в каплю краски на предметном стекле, после чего каплю накрывают покровным стеклом.
Препараты убитых микроорганизмов.
Такими препаратами пользуются в тех случаях, когда необходимо рассмотреть детали строения клеток (ядро, включения, споры), произвести подсчет микроорганизмов и т. д. Для этого микроорганизмы фиксируют на предметном стекле и окрашивают. Приготовление препарата состоит из ряда операций.
Каплю с микроорганизмами петлей распределяют возможно более тонким слоем на обезжиренном предметном стекле площадью около 4 см2. Можно приготовить мазок, пользуясь стеклом со шлифованным краем, которое для распределения капли передвигают вдоль предметного стекла. Затем препарат высуши-вают при комнатной температуре. Для ускорения высушивания препарат мазком вверх осторожно прогревают над пламенем горелки.
Следующая важная операция — фиксация, целью которой является убить микроорганизмы и закрепить их на стекле. Существует много способов фиксации. Простейшим из них является фиксация пламенем. Для этого препарат медленно 3—4 раза проводят над верхней частью пламени горелки таким образом, чтобы сильно нагреть нижнюю поверхность стекла, чем и достигается фиксация. Для фиксации микроорганизмов также широко применяют растворы различных химических веществ: этиловый спирт (96% об.) в течение 5—20 мин; смесь равных объемов этилового спирта и эфира —5 мин; метиловый спирт — 5 мин; смесь формалина (5 мл) со спиртом (95 мл) — 2 мин и др.
На фиксированный препарат наносят раствор какого-либо красителя в зависимости от цели исследования.
Прямое флуорохромирование — это непосредственная окраска живых или фиксированных микроорганизмов флуоресцирующими красителями, такими, как берберин-сульфат, акридин оранжевый, аурофосфин, нейтральная красная, примулин и др. Они объединяются по двум признакам: по способности ярко люминесцировать в сине-фиолетовых или ультрафиолетовых лучах и по избирательному связыванию с определенными тканевыми или клеточными элементами. При окраске для наблюдений за формой микроорганизмов применяют водно-спиртовые растворы метиленовой синей или метиленовой фиолетовой (насыщенный спиртовой раствор, разведенный в 5—10 раз водой). Окрашивание длится 3—5 мин. после чего краску сливают, препарат промывают легкой струей дистиллированной или водопроводной воды и высушивают. На сухой мазок наносят каплю воды, накрывают стеклом и микроскопируют. Если для исследования пользуются иммерсионной системой, то иммерсионное масло наносят непосредственно на сухой мазок.
Окраска по Граму — это важный диагностический признак. Метод основан на том, что протоплазма одних видов микроорганизмов образует прочное, нерастворимое в спирте соединение йода с красителем; у других видов это соединение не образуется. Для окраски препарат фиксируют и обрабатывают карболовым раствором генцианового фиолетового, затем раствором Люголя. Из микроорганизмов, развивающихся в сусле и в вине, красятся по Граму (грамположительные), имеют сине-фиолетовый цвет — дрожжи, молочнокислые бактерии (стрептококки и палочки); не красятся по Граму (грамотрицательные), имеют красный цвет — уксуснокислые бактерии.
Окраска клеточных включений. Каплю исследуемой жидкости смешивают на предметном стекле с каплей, водного раствора красителя, накрывают покровным стеклом и через 5 мин микроскопируют. При прижизненной окраске волютин чаще всего образует зерна в вакуолях. При окраске нейтральной красной и метиленовой синей (растворы 1: 5000) волютин в вакуолях клеток дрожжей выпадает в виде ярко окрашенных красных или синих шариков. При окраске фиксированного препарата метиленовым синим волютиновые зерна приобретают фиолетовый или фиолетово-красный цвет, а цитоплазма клетки окрашивается в голубой. Хорошо окрашиваются также включения молочнокислых бактерий— палочек. Для наблюдений живых микроорганизмов готовят 0,01%-ные и 0,001 %-ные водные растворы красок. Для этого 10 мг сухой краски растворяют в 1 л дистиллированной воды. Для окраски фиксированных препаратов готовят растворы в соотношении 1 :40 (1 мл насыщенного спиртового раствора краски смешивают с 40 мл воды). Гликоген почти всегда содержится в клетках микроорганизмов в виде включений или в растворенном состоянии в цитоплазме. Характерной для него является окраска йодом в красно-бурый цвет.
Для обнаружения гликогена на фиксированных препаратах используют крепкий раствор йода (7 г йода+ 20 г йодистого калия + 100 мл дистиллированной воды). Препарат рекомендуется предварительно обезжирить, можно при фиксировании в смеси спирта с эфиром 1 : 2. Для прижизненного окрашивания микроорганизмов, используют раствор Люголя (0,33 г йода кристаллического+ 0,66 г йодистого калия+100 мл воды дистиллированной). Сначала в 10 мл воды растворяют йодистый калий, затем — йод и доливают водой до 100 мл. Жир в клетках микроорганизмов чаще всего встречается в виде липопротеидных телец.
Для окраски жира используют раствор 0,1 г судана (судан III) в 20 мл 95%-ного спирта или в концентрированной молочной кислоте. К капле густой суспензии микроорганизмов на предметном стекле добавляют каплю 40%-ного формалина и оставляют на 5 мин. К фиксированному таким образом препарату прибавляют каплю раствора метиленовой синей (1 :40) и оставляют на 10 мин. Затем добавляют каплю свежеприготовленной смеси равных объемов спиртового раствора Судана и воды. Плазма окрашивается в синий цвет, капли жира в розовый, а вакуоли остаются бесцветными. Сера может быть, в клетках в виде полужидких маслянистых капель, сильно преломляющих свет.
Чтобы убедиться, что клетки дрожжей содержат "элементарную серу", их следует высушить, затем растворить капли серы в сероуглероде или безводном спирте, или в растворе гидроксида калия и соды (в последней при нагревании). Обработав препарат высокой температурой, затем в течение 1 мин концентрированной пикриновой кислотой, после промывания водой можно наблюдать кристаллизацию серы в виде одноклиномерных кристаллов, чаще расположенных вне клеток. При наличии большой массы дрожжей ее высушивают, помещают в сероуглерод, а затем профильтровывают настой, дают ему испариться на часовом стекле. Полученный желтый маслянистый остаток при сжигании превращается в сернистый ангидрид, легко обнаруживаемый по характерному запаху.
