Главная / В помощь специалисту / Паразитология

Микроскопическое исследование мокроты, промывных вод бронхов, лаважной жидкости для диагностики гельминтозов.

Исследование мокроты

Необходимые реактивы и оборудование
1. Раствор NaOH или КОН 0,5 %-ный
2. Центрифужные пробирки
3. Предметные стекла, большие предметные стекла
4. Центрифуга
5. Микроскоп

Подготовка к работе
Мокроту, представляющую собой патологический секрет дыхательных путей вместе с отделяемым носоглотки и полости рта, собрать в стерильную (можно прокипяченную стеклянную емкость с крышкой и исследовать сразу после доставки в лабораторию. Исследуется мокрота, выделенная при откашливании (не слюна и не слизь с носоглотки).
При слизисто-гнойной мокроте для лучшего растворения слизи, гноя:
• мокроту смешать с равным объемом 0,5 %-ного раствора едкой щелочи;
• слегка подогреть пробирку на водяной бане;
• пробирку энергично встряхивать в течение 5 мин.

Исследование нативного мазка мокроты

Ход исследования
• Мокроту из стеклянной емкости пипеткой переносят на предметное стекло (лучше большое).
• Приготовить мазок путем равномерного растирания между двумя предметными стеклами или нанесения и равномерного растирания палочкой на большом предметном стекле.
• Микроскопировать при увеличении: объектив х8 или х10, окуляр х10, для уточнения морфологических особенностей окуляр х40.

Исследование мокроты с центрифугированием
Ход исследования
• Перелить мокроту в центрифужные пробирки.
• Центрифугировать в течение 3—5 мин при 1500 об/мин.
• Слить надосадочную жидкость.
• Перенести осадок пипеткой или сразу из пробирки на предметное стекло.
• Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр х 10, для уточнения
морфологических особенностей окуляр х 40.
Эффективность метода
• Эффективен для выявления яиц гельминтов, паразитирующих в легких, бронхах (яйца парагонимуса томинкса), иногда яиц шистосом.
• Менее эффективен при диагностике личиночных стадий кишечных нематод в период миграции через легкие (личинки аскарид, анкилостомид, стронгилоидеса).
• Иногда можно обнаружить личиночные стадии эхинококков (сколексы эхинококка, альвеококка) при поражении легких и прорыве пузырей в бронх.
Применение метода
• Для диагностики легочных гельминтозов.

Исследование окрашенных мазков на пневмоцистоз
Необходимые реактивы и оборудование
Химреактивы
1.Для приготовления мазков - муколитики (0,3 %-ный дитиотреитол в 0,02 М ЭДТА, рН=7,0) или ацетилцистеин, или 4 %-ный р-р NaOH; формалин, спирт.
2. Для окраски мазков по Романовскому-Гимзе - смесь Никифорова; сульфатно-уксусный реагент (45 мл ледяной уксусной кислоты и 15 мл концентрированной серной кислоты) -10 %-ная краска Романовского-Гимзы в фосфатном буфере рН=7,2.
3. Для окраски мазков толуидиновым синим - толуидиновый синий 0,15 %-ный (75 мг толуидинового синего + 15 мл дистиллированной воды + 0,5 мл концентрированной соляной кислоты + 35 мл абсолютного спирта); водный метиловый желтый 0,25 %-ный,
4. Для окраски по Гомори-Грохотту - формалин 10 %-ный; дистиллированная вода; раствор хромовой кислоты (5 г хромовокислого оксида + 95 мл дистиллированной воды), 1 %-ный раствор метабисульфита калия (или натрия); рабочий раствор серебра (100 мл водного 3 %-ного раствора метенамина или
уротропина + 5 мл водного 5 %-ного нитрата серебра) - готовится непосредственно перед употреблением; 5 %-ный водный тетраборат натрия (бура); диметилсульфоксид; раствор хлорного золота 0,2 %-ный; водный раствор тиосульфата соды 2 %-ный; лихтгрюн (0,02 г лихтгрюна + 100 мл дистиллированной воды + 5 капель ледяной уксусной кислоты).
5. Для окраски акридиновым оранжевым - маточный раствор: 100 мл акридина оранжевого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, рабочий раствор готовится при разведении маточного раствора в 10—100 раз физиологическим раствором, абсолютный метанол (получают обезвоживанием с помощью окиси кальция с последующей дистилляцией).

Оборудование
1. Центрифужные пробирки
2. Стеклянные палочки
3. Предметные стекла
4. Термостат
5. Центрифуга
6. Микроскоп

Подготовка к работе
• Мокроту или другой материал рекомендуется исследовать немедленно. В исключительных случаях возможно временное сохранение лаважной жидкости с помощью консервации:
а) лаважную жидкость слить в стоящую во льду посуду с 50 мл раствора Хенкса коммерческого, рН=7,2—7,4;
б) лаважную жидкость заморозить до -4° С.
• Подготовка предметных стекол: желательно использовать альбуминизированные стекла.

Ход исследования
Приготовление мазков мокроты

Поместить мокроту в центрифужную пробирку.
Добавить равное количество муколитика.
Полученную смесь быстро перемешать.
Поместить в термостат при температуре 37 °С на 5—15 мин,
Развести смесью формалина и спирта (1:1).
Центрифугировать 10 мин при 1500 об/мин.
Слить надосадочную жидкость.
Осадок перенести на 4—8 предметных стекол.
Осадок нанести на стекло в виде тонкого мазка.
Мазок высушить на воздухе.

Приготовление мазков лаважной жидкости

Поместить лаважную жидкость в центрифужную пробирку.
Добавить равное количество 50°-ного спирта и перемешать.
Центрифугировать 20 мин при 2500 об/мин.
Слить надосадочную жидкость.
Осадок перенести на 4—8 предметных стекол.
Осадок нанести на стекло в виде тонкого мазка.
Мазок высушить на воздухе.

Окраска мазков

A) Скрининговая окраска по Романовскому-Гимзе

Высушенный мазок фиксируют в смеси Никифорова в течение 10—15 мин.
Опустить мазок в сульфатно-уксусный реагент на 10 мин.
Промывать проточной водой в течение 5 мин.
Высушить мазок на воздухе.
Окрашивать 10 %-ной краской Романовского-Гимзы в течение 30 мин.

Результат: цитоплазма трофозоитов голубоватая, ядро - розовое, внутрицист тельца имеют фиолетовое ядро.

Б) Окончательная или специфическая окраска толуидиновым синим

Высушенный мазок фиксируют в 10 %-ном растворе формалина.
Промыть дистиллированной водой.
Опустить мазок в сульфатно-уксусный реагент на 5 мин.
Реагент перемешать стеклянной палочкой.
Оставить мазок в сульфатно-уксусном реагенте еще на 10 мин.
Промыть проточной водой.
Высушить мазок на воздухе.
Окрашивать 0,15 %-ным толуидиновым синим в течение 3 мин.
Промыть проточной водой.
Высушить мазок на воздухе.
Докрашивать в 0,25 %-ном растворе водного метанилового желтого в течение 2 мин.
Промыть водой.

Результат: четко дифференцируется стенка пневмоцист, но не дает представление клеточном содержимом; цисты сине-фиолетовые, тканевые элементы и фон - зелен: желтые.

Б) Окончательная или специфическая окраска по Гомори-Грохоту
Высушенные мазки фиксируют в 10 %-ном растворе формалина в течение 5—10 мин Промыть дистиллированной водой.
Быстро подогреть раствор хромовой кислоты в стакане до 65 °С. В нагретый раствор быстро погрузить мазки на 1 мин. Промыть дистиллированной водой.

Опустить мазки в 1 %-ный раствор метабисульфита калия на 1 мин.
Приготовить раствор: 25 мл рабочего раствора серебра + 25 мл дистиллированной воды +2 мл 5 %-ного водного тетрабората натрия + 15 мл диметилсульфоксида.
Опустить мазки в приготовленный раствор.
Подогреть до 90—95 °С, пока мазки не станут темно-коричневыми, а раствор светло-серым.
Прополоскать мазки в трех сменах дистиллированной воды.
Опустить мазки в 0,2 %-ный водный раствор тиосульфата соды
Промыть дистиллированной водой.
Окрашивать лихтгрюном в течение 5 мин.
Промыть дистиллированной водой.

Результат: цисты светло- или темно-коричневые (цвет зависит от толщины мазка), округлой или чашеобразной формы, окружающий фон и тканевые элементы зелено-желтые.

Г) Окраска акридином оранжевым.

Высушенные мазки фиксируют в абсолютном метаноле в течение 2 мин.
Окрасить рабочим раствором акридина оранжевого 10 мин.
Промыть дистиллированной водой.
Высушить окрашенные мазки на воздухе.
Микроскопировать под масляной иммерсией при увеличении: объектив х90 или х100, окуляр х7 или х10.

Эффективность метода

Метод эффективен при условии немедленного исследования материала и использования двух вариантов окрашивания параллельно.

Применение метода

Метод применяют для диагностики пневмоцистоза.
Другой материал на пневмоцистоз (слизь из горла и гортани, аспираты из бронхов, биоптаты и мазки-отпечатки легочной ткани) исследуется так же, как и мокрота.

< вернуться к списку