Темное поле
Метод темного поля основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света, внутренняя апертура которого должна превосходить числовую апертуру применяемого объектива. Таким образом, ни один прямой луч не попадает в объектив: при отсутствии объекта поле зрения микроскопа будет темным, а при его наличии — контрастный светлый объект будет виден на темном фоне в отраженном или рассеянном (диффузно отраженном) свете.
 |
 |
|
Диатомовые водоросли,Светлое поле микроскоп Olympus CX41, объектив 10Х |
Диатомовые водоросли,Тёмное поле микроскоп Olympus CX41, объектив 10Х |
Для создания темного поля в биологическом микроскопе применяют: щелевой метод; упрощенный метод, связанный с одновременным диафрагмированием осветительной апертуры конденсора и выходной апертуры объектива, при этом объектив должен иметь ирисовую диафрагму или вкладыш, которые позволяют уменьшать выходное отверстие объектива, приближая его к осветительной апертуре, оптимальной для получения эффекта темного поля; специальный конденсор темного поля. Метод исследования в темном поле впервые был предложен австрийскими учеными Р.Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 г.
Рис. 1. Принцип темнопольной микроскопии состоит в том, что свет нулевого порядка дифракции вообще не участвует в формировании изображения.
Темнопольные конденсоры высокого разрешения.
Универсальные конденсоры имеют в своем составе гнездо для установки темного поля, и в большинстве лабораторий имеются темнопольные конденсоры различной степени сложности.
Некоторые из сухих темнопольных конденсоров, например те, которые имеются в микроскопах Olympus, очень просты в обращении. После установки освещения по Кёлеру для светлого поля конденсор удаляют и заменяют на темнопольный, который устанавливается вплотную к предметному столику. В Olympus также выпускают конденсоры, которые устанавливаются на место светлопольных (слайдер-конденсеры), однако большинство конденсоров темного поля высокого разрешения требуют использования иммерсии, наносимой на нижнюю часть предметного стекла.
Рис.2.Универсальный конденсор со вставками для тёмного поля и фазового контраста.Темнопольной вставки соответствует маркировка DF.
Последовательность шагов для установки темного поля c помощью темнопольной вставки.
1. Сфокусируйте препарат на светлом поле
Найдите оптимальный фокус препарата на светлом поле.
Снимите центрируемую линзу конденсора CX-AL
Фокусировочная линза нужна для юстировки микроскопа при настройке по Кёлеру.
Установите темнопольную вставку на фокусировочную линзу
Установите темнопольную вставку на CX-AL и вмонтируйте её обратно до характерного щелчка.
Темнопольная вставка отсекает прямое освещение препарата и пропускает только боковое освещение.
После введения темнопольной вставки в оптический путь , освещение препарата будет не прямое, а боковое.
Рекоммендуется добавить яркости лампы для получения изображения.
Полевая и апертурная диафрагмы микроскопа при темнопольной микроскопии должны быть открыты, как на изображениях ниже:
 |
 |
| Открытая полевая диафрагма микроскопа | Открытая апертурная диафрагма |
Конус света, выходящего из конденсора в рассеивающем кубе
1. Нанесите каплю масла на полированную поверхность рассеивающего куба или флуоресцирующего перспекса. Одновременно нанесите капельку масла на вершину линзы конденсора. Поместите кубик на столик и приведите его в контакт с маслом на конденсоре NB. Для того, чтобы пользоваться данным методом, надо быть уверенным в том, что при соприкосновении двух выпуклых поверхностей масляных капель все пузырьки воздуха вытолкнуты в стороны.
2. Используя установку конденсора для светлого поля, посмотрите со стороны на конус света в кубике. Его угол регулируется апертурной диафрагмой конденсора, а высота вершины конуса от поверхности конденсора — рабочим расстоянием конденсора. При установке света по Кёлеру вершина конуса оказывается внутри препарата. Помните, что при нормальной работе к конденсору добавляется толщина предметного стекла.
3. В универсальном конденсоре можно переводить отверстия для установки фазовых колец. Посмотрите на конусы света от каждого из колец. Заметьте, что все они внутри полые, но сходятся к объективу, когда он правильно установлен.
4. Установите темнопольный конденсор, и вы увидите конус с очень большим углом, тоже полый внутри, причем его угол столь велик, что выходит за пределы объектива.
Обратите внимание, что в отсутствие масла между вершиной конденсора и основанием кубика эти лучи света не попадут в кубик, поскольку они падают на него под углом, большим, чем критический угол для данного мате риала, и, следовательно, будут отражаться.
Ограничения конденсоров темного поля высокого разрешения.
В некоторых случаях при работе с темнопольными конденсорами и заранее приготовленными препаратами возникают трудности. Причина, состоит в том, что расстояние до вершины конуса падающего света слишком мало для того, чтобы эта вершина могла оказаться внутри образца, который смонтирован на толстом стекле. В такой ситуации не остается ничего другого, как поискать относительно редкий тип фокусируемого темнопольного конденсора. В противном случае придется перезаключать препарат, используя более тонкое предметное стекло.
Другое ограничение метода темнопольной микроскопии состоит в том, что в поле зрения оказывается слишком много деталей, таких, как пузырьки воздуха или инородные частицы, которые ухудшают изображение. Таким образом, данный метод лучше всего использовать для изучения мелких дискретных структур, достаточно удаленных друг от друга.
