Флуоресценция
Флуоресцентные методы исследования основаны на наблюдении микроскопических объектов с использованием их способности к свечению.
По сравнению с методами обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ:
- цветное свечение,
- высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне,
- возможность исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов,
- возможность исследования различных жизненных процессов в динамике их развития,
- возможность бнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.
В медицинской микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител.
В основе флуоресцентной микроскопии лежит способность некоторых веществ поглощать свет определенной части спектра, энергия которого затем частично выделяется в виде света. Испускаемый свет отличается от поглощенного света длиной волны и интенсивностью. В соответствии с правилом Стокса длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого света, и эта разность длин волн лежит в основе наблюдения флуоресценции при флуоресцентной микроскопии. Интенсивность испускаемого света меньше, чем интенсивность возбуждающего света, так как количество выделяемой энергии во много раз меньше того количества энергии, которое требуется для возбуждения.
Для наблюдения флуоресценции абсолютно необходимо предотвратить смешение в микроскопическом изображении возбуждающего света и испускаемой флуоресценции. Качество изображения во флуоресцентной микроскопии в значительной степени определяется контрастом и яркостью изображения. Контраст изображения определяется отношением флуоресценции специфически окрашенных структур к фоновому свету. Однако оптимальный контраст может достигаться в слабых флуоресцентных изображениях благодаря, например, использованию узкополосных светофильтров, которые часто имеют небольшое пропускание. В то же время для облегчения визуальных наблюдений, для фотографирования с использованием относительно коротких выдержек и для измерений требуется сравнительно яркое изображение. Таким образом, в большинстве случаев необходимо достичь компромисса между интенсивностью специфической флуоресценции и уровнем неспецифической флуоресценции фона.
