Фазовый контраст
Принцип метода
В заднюю фокальную плоскость (з. ф. п.) объектива вводится пластинка, создающая два эффекта:
- изменение фазы света нулевого порядка дифракции по отношению к другим порядкам;
- снижение интенсивности света нулевого порядка и в результате — уравнивание его с другими порядками.
Схема метода
В современных микроскопах пластинка содержит кольцевое отверстие, которое отличается по толщине от остальной части пластинки и покрыто тонким слоем серебра для частичного поглощения светового потока от нулевого максимума. Для того чтобы свет попадал в фазовое кольцо, в передней фокальной плоскости конденсора, то есть в плоскости, сопряженной с з. ф. п. объектива, устанавливается кольцевое отверстие.
Глядя в фазовый телескоп, который вставляется вместо окуляра и фокусируется на з. ф. п. объектива, эти два кольца нужно подобрать по размерам и совместить как указано ниже.
Методика установки фазового контраста
1. Проверьте наличие фазово-контрастных объективов и соответствующего конденсора, желательно также иметь вспомогательный телескоп, необходимый для наблюдения з. ф. п. объектива.
2. Рассмотрите препарат буккального эпителия, используя освещение по Кёлеру. Обратите внимание на очень низкий контраст при нормальном светлопольном освещении. Некоторое усиление контраста, необходимое для обнаружения клеток, достигается при закрывании диафрагмы конденсора.
3. Найдя клетки, откройте апертурную диафрагму и установите соответствующее кольцо в конденсоре — оно обозначается окрашенной полоской или цифрой.
4. Сфокусировав телескоп из з. ф. п., совместите изображение освещающей кольцевой диафрагмы и фазового кольца, которое выглядит более темным на общем фоне. Если изображение светлого кольца слишком большое или маленькое или оно расфокусировано, то это значит, что вы неправильно установили свет по Кёлеру или же опустился конденсор. В этом случае установите фокус конденсора. Если размер светлого кольца явно не соответствует темному кольцу, то вы неправильно выбрали кольцо на конденсоре, это необходимо проверить. Теперь вы создали все условия для фазового контраста, за исключением того, что не ввели зеленый светофильтр. Не все им пользуются, однако он желателен, так как сдвиг длины волны 360°/4 рассчитан именно для зеленого света и не вполне соблюдается для белого света, представляющего собой смесь различных длин волн.
5. Замените телескоп на окуляр и проводите наблюдения. Вам может понадобиться увеличить накал лампы осветителя, но следите за тем, чтобы не перекалить ее. Вы можете сначала настроить микроскоп с помощью контрастного препарата, а затем заменить его на препарат прозрачного слоя клеток, чтобы оставить ту же плоскость фокуса, если толщина предметного стекла та же.
6. Установите объектив высокого разрешения и повторите этапы 1—4. Большинство микроскопов отцентрированы для смены различных объективов и конденсоров, но все же лучше время от времени проверять центровку. Для работы с фазовым контрастом необходимо проверить наличие соответствующих аксессуаров в вашем микроскопе, кроме того, желательно иметь зеленый светофильтр. Проверьте также регулировочные винты для фазового контраста, которые должны ходить независимо от центровочных винтов конденсора. Если в микроскопе установлено освещение по Кёлеру, то кольцевая пластинка в конденсоре будет находиться в плоскости, сопряженной с фазовой пластинкой з. ф. п. объектива, и если при установке объектива и кольцевой пластинки вы правильно следовали маркировке фирмы-изготовителя, то в з. ф. п, оба кольца будут хорошо перекрываться. При микроскопии образец всегда рассеивает свет, так что свет, прошедший через образец, имеет меньшую интенсивность, чем тот, который не проходил через него. (Сравните, например, интенсивность нулевого порядка дифракции в присутствии и в отсутствие препарата.) Рассеяние света есть результат его дифракции и преломления, а также отражения и поглощения. В случае прозрачного образца рассеянный свет выходит из препарата с фазовыми сдвигами относительно нулевого максимума. Для монослоя клеток эта разность фаз составляет около четверти длины волны, а не 1/2 длины волны. При таком малом сдвиге фаз интерференция не будет достаточно сильной, чтобы изменение амплитуды было заметным для глаза. Фазово-контрастный микроскоп приводит эти фазовые сдвиги к такому уровню, который может дать различимую интерференционную картину.
Интерпретация фазово-контрастных изображений
Изображение в фазово-контрастном микроскопе создается в результате интерференции световых пучков, относительная фаза которых была изменена светособирающим устройством. Таким образом, изображение представляет собой карту разностей длин оптических путей между деталями препарата или между препаратом и фоном. Поскольку коэффициенты преломления белковых растворов зависят от их концентраций, то изображение в фазово-контрастном микроскопе представляет собой также и карту концентраций или масс белков и других компонентов протопласта. Обратите внимание, что для достижения высокого контраста необходимо, чтобы дифрагированный свет был достаточно отделен от света нулевого порядка на всем оптическом пути, с тем чтобы первый не попал в фазовое кольцо в з. ф. п. объектива.
 |
 |
| Диатомовые водоросли, светлое поле, объектив 10Х | Диатомовые водоросли,фазовый контраст, объектив 10Х |
