Дифференциально интерференционный контраст
Дифференциально интерференционный контраст (интерференционный контраст по Номарскому), - наиболее популярный метод достижения контраста, используемый сейчас даже чаще, чем фазовый контраст. Он уже давно применяется в материаловедении, где часто используется падающий свет, а теперь метод Номарского быстро вытесняет фазовый контраст в биологических исследованиях. Принцип метода состоит в том, что луч плоскополяризованного света расщепляется призмой Волластона на два луча. Оба они проходят через объект очень близко друг к другу, однако достаточно далеко для глаза наблюдателя что создает эффект объемности за счет различий в интенсивностях освещенности деталей в конечном изображении. Два луча совмещаются второй призмой Волластона, расположенной в задней фокальной плоскости объектива. Анализатор завершает формирование изображения. Два луча имеют боковой сдвиг друг относительно друга, и направление сдвига воспринимается как направление подсветки изображения с одной стороны. Разность длин оптических путей двух лучей обычно устанавливается так, чтобы получился так называемый нулевой серый фон, на котором объект будет ограничен соответственно светлой или темной каймой. Однако, перенастроив микроскоп, можно добиться поворота тени на 180°. Поворот тени дает интересный эффект. Препарат, который сначала имел сходство с яичницей-глазуньей, после перенастройки приобретает вид пластинки с углублениями. Это необходимо учитывать, представляя фотомикрографии, полученные этим методом. Аналогичный результат может получиться, если поворачивать отпечаток.
Сильно передвинув призму Волластона, можно получить окрашенное изображение на приятном цветном фоне. Цвета снова относятся к отрицательной части интерференционной шкалы Ньютона для белого света. Микроскопы, работающие в падающем свете, имеют лишь одну призму Волластона, которая служит одновременно для освещения и в качестве призмы объектива.
В дифференциально интерференционном (DIC) микроскопе скрещенные поляризаторы расположены по ходу лучей, так что любое двулучепреломляющее вещество в препарате при определенной ориентации будет ярко светиться. Кроме того, следует помнить, что направление тени может совпадать с направлением линейных структур в препарате, и тогда они не дают нормального изображения.
Использование дифференциального интерференционного контраста
Метод широко используется для изучения неокрашенных препаратов. Это превосходный метод для визуализации р. о. п. в препарате. Эффект достигается за счет образования тени на границах областей с р. о. п. Однако данный метод не следует применять для количественных измерений оптических путей.
Методика установки дифференциального интерференционного контраста
1. В описании микроскопа посмотрите маркировку установленных в конденсоре призм Волластона для соответствующих объективов.
2. Приготовьте препарат клеток буккального эпителия в слюне или в изотоническом растворе. Накройте их покровным стеклом толщиной 0,17 мм.
3. Наладив освещение по Кёлеру, установите интерференционный конденсор для нормального режима освещения (вынимая конденсор из коробки, вы, возможно, заметите, что на оправе его нанесена метка, указывающая направление сдвига лучей).
4. Установите поляризатор.
5. Найдите клетки, ориентируясь либо по пузырькам воздуха в слюне, либо вновь закрывая диафрагму конденсора для усиления контраста в поглощенном свете.
6. Вращая револьвер конденсора, установите соответствующую объективу призму Волластона.
7. Выньте окуляр и рассмотрите заднюю фокальную плоскость объектива.
8. Установите анализатор таким образом, чтобы он находился в скрещенном с поляризатором положении, и, слегка двигая верхнюю призму Волластона, получите в задней фокальной плоскости полосу минимальной интенсивности. Закройте затем апертурную диафрагму до размера, несколько большего, чем диаметр темной полосы.
9. Установите окуляр и посмотрите на изображение. Клетки будут выглядеть трехмерными. Отметьте направление бокового отсвета от них.
10. Слегка перемещая вторую призму Волластона, следите за изображением, и вы увидите, что можно поменять направление бокового отсвета на обратное. Возможно, вы заметите, что в то же время изменилось распределение в изображении «холмов» и «долин».
11. Абсолютно необходимо убедиться, что изображение, которое вы наблюдали, есть следствие определенной установки микроскопа.
12. При такой установке микроскопа за счет разности длин оптических путей для различных деталей препарата и их окружения создается контрастное изображение. Каждое изменение длины оптического пути дает краевой эффект, за счет чего и создается впечатление трехмерности.
13. Для того, чтобы получить цветное изображение, надо вернуться к этапу 8, где, слегка двигая призму в любую сторону от серой полоски нулевого порядка, следует получить окрашенную полоску.
