Общие сведения о конфокальном микроскопе.
Конфокальная микроскопия имеет серию преимуществ перед обчной широкопольной оптической микроскопией, включая возможность контролировать глубину поля зрения, невелировать размытое фоновое изображение из фокальной плоскости (которое в широкопольной флуоресценции ведет к ухудшению качества изображения) и возможноть получать серию оптических срезов толстых препаратов. Ключевым в конфокальной микроскопии является использование устройств, позволяющих исключить внефокусный свет и слишком яркое свечение образцов, чья толщина превышает непосредственную плоскость фокуса.
В последнее время популярность конфокальной микроскопии резко возрасла, благодаря той простоте, с которой получаются высококачественные флуоресцентные изображения и огромной возможности применений в клеточной биологии, которая работает как с фиксированными так и с живыми клетками и тканями. По факту, конфокальная микроскопия является наиболее важным техническим прорывом в оптической микроскопии.
В классической широкопольной оптической эпи-флуоресцентной микроскопии вторичная флуоресценция, испускаемая препаратом, обычно дает размытое изображение, резкими остаются только детали, полученный из фокальной плоскости образца.
Проблема усложняется в случае использования толстых препаратов (больше чем 2 микрометра), которые обычно проявляют такой высокий уровень флуоресцентной эмиссии, что многие из тонких деталей утрачиваются.
Конфокальная микроскопия позволяет увеличивать оптическое разрешение как в аксиальном (z; вдоль оптической оси) так и в латеральном (x и y; в плоскости препарата) направлении и исключать "внефокусный" свет из результирующего изображения. Даже несмотря на то, что разрешение в конфокальном микроскопе больше, чем в обычном широкопольном, оно все еще несравнимо меньше электронного микроскопа. Именно поэтому конфокальная микроскопия может считатся промежуточным звеном между этими двумя классическими методами в микроскопии.
На рис.1 показана серия фотографий, сравнивающих изображение полученное с широкопольного флуоресцентного микроскопа и лазерного конфокального сканирующего микроскопа.
Толстый срез окрашенного флуоресцирцющими красителями костного мозга человека обнаруживает очень яркое свечение флуоресцирующих структур из фокальной и внефокальной плоскости образца при исследовании на классическом флуоресцентном микроскопе (рис.а). На лазерном сканирующем конфокальном микроскопе мы видим существенно более четкое и детализированное изображение (рис.d).
Подобно этому мышечные фибриллы кролика дают размытое изображение при широкопольной флуоресценции (b) и хорошее разрешение и четкую исчерченность на конфокальном микроскопе (e).
Автофлуоресцирующая пыльца подсолнечника на широкопольном флуоресцентном микроскопе показывает размытые очертания обекта и позволяет судить только об общей морфологии (c). В отличии от этого изображения благодаря тонким оптическим срезам, получаемым на конфокальном микроскопе мы видим внутреннюю структуру обекта и можем судить о ядре и оболочке пыльцевого зерна (f).
По материалам ресурсного центра Olympus www.olympusmicro.com
