Обезвоживание гистологического материала
Обезвоживание материала
Обезвоживание фиксированных объектов обязательно предшествует их заливке в парафин и целлоидин. Из фиксированных объектов можно готовить срезы и без заливки при помощи замораживающего микротома (замораживающего столика) и вибратома.
Для обезвоживания материала обычно используют несколько порций этилового спирта восходящей крепости. Кроме этанола для обезвоживания может быть применен безводный ацетон (ЧДА), изопропанол, диоксан, глицерин.
Обезвоживание ускоряется при постоянном перемешивании жидкости, которое обеспечивают автоматизированные системы проводки.
Продолжительность пребывания объектов в спиртах обусловлена их размерами, свойствами тканей и особыми задачами исследования (например, необходимостью максимального удаления липоидов из нервной ткани при окраске по Нисслю, перед заливкой в целлоидин).
Перед обезвоживанием материала производят подготовку фиксированных кусочков органов и тканей для гистологического исследования (вырезку). Вырезанные кусочки должны иметь толщину не более 0,8 см (оптимально 0,4-0,5 см), длину и ширину в пределах 1,5-2,0 см, т.е. не превышать длину сторон стандартного покровного стекла.
Перед проводкой материала кусочки органов и тканей, которые были фиксированы в формалине, промывают в проточной воде (до 24 ч) и подсушивают на фильтровальной бумаге.
Обезвоживание материала, фиксированного в формалине, рекомендуется начинать с 70-80%-ного этанола, в котором объекты могут находиться длительное время без существенного сжатия и изменения тинкториальных свойств. Дальнейшая обработка может различаться в зависимости от размера вырезанных кусочков и возможности использования абсолютного спирта. Ускорения процесса обезвоживания можно добиться, вырезая кусочки тканей меньшего размера (например, 1 х 0,5 х 0,3 см), обеспечив постоянное перемешивание растворов (например, в автоматизированной системе гистологической проводки) и проводя обезвоживание при 37°С в термостате.
Для обезвоживания кусочков обычного размера (1-2 x 1-1,5 x 0,5-0,8 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки (при комнатной температуре без постоянного перемешивания).
1) Этап
Этанол 80 % 18-24 ч
Этанол 96 % (I) 18-24 ч
Этанол 96 % (II) 18-24 ч
Этанол абсолютный 6-24 ч
2) Этап
Этанол 80% 18-24 ч
Этанол 96% (I) 18-24 ч
Этанол 96% (II) 18-24 ч
Этанол 96% (III) 18-24 ч
3) Этап
Этанол 80% 18-24 ч
Этанол 96% (I) 18-24 ч
Этанол 96% (II) 18-24 ч
Метилсалицилат (или метилбензоат) - этанол 96% (1:1) 2 ч
Метилсалицилат (или метилбензоат) 12-24 ч
Большее повышение температуры растворов не рекомендуется в связи с опасностью сжатия и чрезмерного уплотнения тканей. Плотные объекты (кожа, декальцинированная кость) обезвоживать при повышенной температуре не следует.
В метилсалицилате материал можно оставить хранится длительное время без ухудшения качества препаратов. Так как проводка через метилсалицилат и метилбензоат приводит к смягчению плотных объектов, ее полезно использовать при обработке кусочков кожи и органов, содержащих много мышечной и соединительной ткани.
Для обезвоживания маленьких кусочков (размерами до 1 x 0,5 x 0,3 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки.
1) Этап
Этанол 80 % 6-8 ч
Этанол 96 % (I) 12-24 ч
Этанол 96 % (II) 4-24 ч
Этанол абсолютный 2-4 ч (при комнатной температуре)
2) Этап
Этанол 80% 6-8 ч
Этанол 96% (I) 12-24 ч
Этанол 96% (II) 6-24 ч
Этанол 96% (III) 3-5 ч (при комнатной температуре)
3) Этап
Этанол 80% 2-4 ч
Этанол 96% (I) 6-18 ч
Этанол 96% (II) 2-4 ч
Этанол 96% (III) 2-4 ч (при температуре 37°С).
Высокое качество обезвоживания может быть достигнуто только при использовании этанола, соответствующего указанной крепости. Поэтому качество поступающего в отделение спирта необходимо проверять с помощью ареометра. Объем обезвоживающего раствора должен не менее, чем в 10 раз превышать объем погруженных в него обезвоживаемых объектов.
