Заливка гистологических объектов в парафин
Получение тонких срезов с образцов исследуемых тканей возможно только после их пропитывания достаточно плотными средами, какими являются парафин и целлоидин.
Парафин - смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, получаемая при перегонке нефти. Сорта парафина, используемые в качестве среды для гистологической заливки, имеют температуру плавления от 48° до 60°С. Наиболее удобен в повседневной работе парафин с температурой плавления 52°-56°С. Технический, пищевой и медицинский парафины без дополнительной подготовки не позволяют производить заливку, обеспечивающую высокое качество срезов. В гистологической лаборатории желательно использовать очищенные сорта парафина с добавлением восков или специально разработанные на основе парафина среды с модифицирующими добавками (Paraplast -Sigma (CШA), Histoplast - Shandon (CШA), Histomix - БиоВитрум (Россия).
Пропитку парафином проводят в термостате, обеспечивающем поддержание температуры на 1-2 градуса выше температуры плавления используемого парафина (обычно устанавливают температуру 58°С).
Поскольку расплавленный парафин и этанол не смешиваются, из обезвоженного материала следует удалить спирт (или метилсалицилат) при помощи промежуточной среды - растворителя парафина, смешивающегося с этанолом. В качестве таких промежуточных сред можно использовать хлороформ, авиационный бензин, петролейный эфир, ксилол, бензол, толуол, октан, гексан и др.
Абсолютный спирт пригоден для обезвоживания (в качестве абсолютного спирта), если его крепость не ниже 98°. В практической работе наиболее часто применяют хлороформ. При доступности абсолютного этанола, хлороформу следует предпочесть менее токсичный петролейный эфир, который лучше удаляет этанол и позволяет достичь более высокого качества пропитки парафином.
Можно рекомендовать следующие схемы проводки и пропитывания материала.
1. Заливка в парафин с использованием хлороформа
Обезвоженные объекты помещают последовательно в:
Смесь абсолютного этанола с хлороформом (1:1) 1-2 ч
Хлороформ (I) 1ч,
Хлороформ (II) 1ч
Хлороформ (III) 1 ч
Хлороформ-парафин (1:1) при 37°С в термостате 12-24 ч
Проводят через 3 порции расплавленного парафина (в термостате при 56°-58°С) по 40-60 мин
2. Заливка в парафин с использованием петролейного эфира.
Обезвоженные объекты помещают последовательно в:
Петролейный эфир (I) 30-60 мин
Петролейный эфир (II) 30-60 мин
Петролейный эфир (III) 30-60 мин
Петролейный эфир-парафин (1:1) при 37°С в термостате 3-24 ч
Проводят через 2 порции расплавленного парафина (в термостате при 5б°-58°С) по 60 мин.
3. Схема проводки материала и заливки в парафин после фиксации объектов в жидкости Буэна, применяемая в Отделе морфологии НИИЭМ РАМН
Перед фиксацией мелкие, тонкие и легко деформирующиеся объекты необходимо поместить на кусочек плотной бумаги.
Фиксация в жидкости Буэна 1 сут. (при комнатной температуре).
Короткая промывка в водопроводной воде 1-15 мин.
70° этанол 1 сут.
80° этанол 1 сут. (можно оставить на срок до 1 недели)
90° этанол 1 сут.
96° этанол 1 сут.
Абсолютный этанол 1 сут.
Абсолютный этанол-хлороформ (1:1) 2-3 ч
Хлороформ (I) 90 мин
Хлороформ (II) 90 мин
Хлороформ-парафин 1:1 в термостате 37° оставить на ночь
Парафин 1 -1 час (в термостате 56-58°С)
Парафин 2 - 1 час (в термостате 56-58°С)
Парафин 3 — 1 час (в термостате 56-58°С)
Неудовлетворительное качество заливки при использовании хлороформа может быть обусловлено применением хлороформа "для спектроскопии", в который добавлен этанол, разливного хлороформа (при использовании недостаточно просушенных после промывки емкостей) и реактива, длительно хранившегося на свету.
При отсутствии возможности использовать абсолютный этанол, этот этап проводки можно пропустить, однако качество пропитки парафином при этом может быть несколько хуже. После обезвоживания с использованием метилсалицилата (или метилбензоата) этот этап следует пропустить. Качество заливки при этом не ухудшится.
По окончании проводки осуществляется заливка - объект помещают в формочку (бумажную, пластиковую или металлическую и заливают свежей порцией разогретого до 58°-65°С парафина. В случае необходимости особой ориентации кусочка ткани при изготовлении срезов, с помощью подогретых препаровальной иглы и глазного пинцета можно повернуть материал, обратив плоскость резки ко дну формочки.
Для получения лучшей консистенции парафинового блока и обеспечения более высокого качества срезов производят ускоренное охлаждение залитых объектов. Для этого формочки (бумажные или пластиковые) опускают в холодную воду или помещают на охлажденную поверхность (на специальный охлаждающий столик или в камеру холодильника при +4°С).
Из затвердевшего парафина (обычно спустя час и более после заливки) подогретым скальпелем вырезают блоки, таким образом, чтобы по периметру кусочка оставалась кайма парафина 1-2 мм. В случае прямоугольных кусочков, которые при изготовлении срезов должны располагаться более длинной стороной параллельно лезвию микротомного ножа, парафин с более коротких сторон может быть подрезан до края ткани. Приготовленные блоки с помощью разогретых скальпеля или специальной лопаточки (шпателя) прикрепляют к деревянному блокодержателю, на котором карандашом, ручкой или фломастером надписывают номер объекта. К изготовлению срезов можно приступать после охлаждения блока.
Металлические и пластиковые (из полипропилена, полистирола и т.п.) формы следует перед заливкой прогреть в термостате.
Разогрев заливочного парафина свыше 56 °С рекомендуется в связи с возможностью быстрого застывания парафина, вынутого из термостата , что приводит к неравномерной заливке блока с сохранением пустот.
До тек пор как парафин не застынет, формочки должны плавать на поверхности воды. Полное погружение в воду до застывания парафина производить не рекомендуется в связи с опасностью
проникновения воды во внутрь блока и его растрескивания и деформации.
Не рекомендуется длительное охлаждение при температурах ниже 0 °С в связи с опасностью появления трещин в блоке.
Применение целлоидина при заливке в парафин
В случае заливки в парафин плотных тканей, из которых трудно изготовить качественные срезы, и при необходимости сохранения формы легко деформирующихся объектов (например эмбрионов) рекомендуется комбинированная заливка в целлоидин-парафин.
Существует несколько методов, цель которых состоит в первоначальной пропитке тканей слабыми растворами целлоидина. Приводимый способ, на наш взгляд, наиболее удачный (по простоте и качеству результатов).
После обезвоживания в абсолютном этаноле (или 96%-ном) кусочки переносят в смесь равных объемов этанола и метилсалицилата на 1-24 ч (до просветления). Затем переносят объекты в чистый метилсалицилат и оставляют на 12-24 ч. Перекладывают материал в 1-2% раствор целлоидина в метилсалицилате и оставляют на 3-7 сут. Отмывают объект от метилсалицилата петролейным эфиром (хлороформом) и переносят в петролейный эфир - парафин (хлороформ-парафин 37°С) или сразу в первый заливочный парафин. Далее продолжают заливку в соответствии с одной из рекомендованных прописей.
Для приготовления раствора целлоидина в метилсалицилате берут 1-2 г целлоидина в хлопьях и помещают в плотно закрывающуюся емкость со 100 мл метилсалицилата, ставят в термостат (37°С) на 2-3 нед. Раз в сутки емкость желательно встряхивать для ускорения растворения целлоидина. Готовый раствор представляет собой прозрачную, слегка желтоватую сиропообразную жидкость, которая может храниться длительное время при комнатной температуре.
